如何得到高產(chǎn)量的RNA粗制品

PCR反應(yīng)特點(diǎn):

　　(1) 特異性強(qiáng)

　　PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

　　①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

　　②堿基配對原則；

　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。

　　其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

　　(2) 靈敏度高

　　PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

　　(3) 簡便、快速

　　PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

　　(4) 對標(biāo)本的純度要求低

　　不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

如何得到高質(zhì)量的rna粗制品

動(dòng)物細(xì)胞mRNA的制備 植物細(xì)胞mRNA的制備 1、mRNA在無細(xì)胞翻譯體系指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力。

無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(Cell-free translation system)，又叫體外轉(zhuǎn)錄-翻譯的偶聯(lián)系統(tǒng),因?yàn)樵撓到y(tǒng)需要制備無細(xì)胞提取物,還有人稱之為溶胞粗制品翻譯系統(tǒng)。無細(xì)胞提取物的制備： 用機(jī)械的,超聲波的,滲透壓或用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┑确椒?將細(xì)胞溶破,再高速離心出去其質(zhì)膜與細(xì)胞核等.該提取液中含有RNA聚合酶,核糖體,tRNA和能量發(fā)生系統(tǒng). 常見的體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng): 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)。網(wǎng)織紅細(xì)胞無細(xì)胞核,其合成的蛋白質(zhì)90%以上為珠蛋白.

如何得到高產(chǎn)量的RNA粗制品?如何得到較純的RNA

答：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。

特異性強(qiáng)

　　PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

　?、僖锱c模板DNA特異正確的結(jié)合；

　?、趬A基配對原則；

　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

　　④靶基因的特異性與保守性。

　　其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

　　靈敏度高

　　PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克（μg=10-6）水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

　　簡便、快速

　　PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

　　對標(biāo)本的純度要求低

　　不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。

如何制備較高純度的rna如何提高rna的收率

1.

碘蒸汽顯色.反應(yīng)完畢后,回收溶劑,將 剩余物倒入 100 mL 水中,HCl 調(diào)至中性后,以乙酸 乙酯萃取,有機(jī)相減壓蒸去溶劑后用 95%乙醇重結(jié) 晶,抽濾后真空干燥得白色固體 5.1 g,收率 78.9%. 2.4 芐基苔黑酚-β-D-四乙酰葡萄糖苷 ( 4)的合成 將芐基苔黑酚( 3)1.1 g ( 0.005 mol)和溴-α-

2.

6), 6.33( m,1H,H -4),5.32( d,J =10.0 Hz,1H,H - 1'),4.11~5.27( m,6H,H-2',3',4',5',6'),2.26 ( s, 3H,CH3),2.03~2.11 ( m,12H,4Ac-H);13 C-NMR ( DMSO-d6 )δ:160.9~170.5 ( 4CO-C)

3.

1 當(dāng)量的氯芐反應(yīng),并在反應(yīng)體系中加入 少量碘化鉀催化得到芐基苔黑酚,保護(hù)基芐基可 通過鈀碳還原脫掉. 3.2 溴代糖的制備 在合成溴代糖時(shí),全乙酰糖比較穩(wěn)定,但溴 代糖極易分解,保存時(shí)應(yīng)注意溶劑是中性的,而 且應(yīng)嚴(yán)格除水,密封冷藏時(shí)間也不宜過久,否則 分解過多無法進(jìn)行下一步成苷反應(yīng). 此外,成苷 反應(yīng)時(shí)可采取少量多次投料的方法,以提高反

如何得到高產(chǎn)量的rna

做定量PCR中用到的 是一段表達(dá)量比較穩(wěn)定的基因 一般作為對照 就是說您在做RT-PCR事為了去除不同標(biāo)準(zhǔn)本再RNA得產(chǎn)量，質(zhì)量，以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能純在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通常選擇內(nèi)參來進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。

內(nèi)參基因的擴(kuò)增可以反映RNA產(chǎn)量，質(zhì)量和CDNA合成效率的變化。

rna的粗提取

RNA抽取一般使用Trizol法抽提: Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性。

目前常用Trizol法進(jìn)行提取組織或細(xì)胞中的RNA。 Trizol作用原理: 在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。 水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。

如何得到高產(chǎn)率的rna粗制品

因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酶是可以識別并附著特定的脫氧核苷酸序列，并對在每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。

根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。

擴(kuò)展資料：

限制性核酸內(nèi)切酶用途：

1、用于DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子堿基序列分析；比較相關(guān)的DNA分子和遺傳工程。

2、限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力.

3、限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。

影響條件：

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。

分布區(qū)域：

限制性核酸內(nèi)切酶分布極廣，幾乎在所有細(xì)菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種限制性內(nèi)切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的就有22種。

有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，酶含量極高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高產(chǎn)酶菌株。

據(jù)報(bào)道從10g的H. aegyptius的細(xì)胞中，能分離提純出可消化l0gλ噬茵體DNA的酶量。到目前為止，細(xì)菌是限制性內(nèi)切酶，尤其是特異性非常強(qiáng)的I類限制性內(nèi)切酶的主要來源。

如何制備高純度的rna

原理：

要進(jìn)行重組DNA 實(shí)驗(yàn),就離不開外源基因的純化,而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上制備,所以制備高質(zhì)量的染色體DNA樣品經(jīng)常為基因工程實(shí)驗(yàn)所需要,抽提細(xì)菌染色體DNA的方法目前已有許多種,這里所介紹的兩種方法：一適用于枯桿菌染色體的抽提；另一種方法則適用于大腸桿菌染色體的制備.

基因工程實(shí)驗(yàn)所需要的基因組DNA 通常要求分子量盡可能大,以此增加外源基因獲得率,但要獲得大片段的DNA 非易事,細(xì)菌基因組DNA通常是個(gè)很大的環(huán)狀態(tài)DNA,而在抽提過程中,不可避免的機(jī)械剪切力必將切斷DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要盡可能地溫和操作,減少剪切力,減少切斷DNA 分子的可能性；分子熱運(yùn)動(dòng)也會(huì)減少所抽提到的DNA分子量,所以提取過程也要盡可能在低溫下進(jìn)行.另外細(xì)胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會(huì)降解制備過程中的DNA,所以制備過程要抑制其核酸酶的活性.

另外制備的細(xì)菌染色體DNA 必須是高純度的,以滿足基因工程中各種酶反應(yīng)的需要,制備的樣品必須沒有蛋白污染,沒有RNA,各種離子濃度應(yīng)符合要求,這些在染色體制備時(shí)都應(yīng)考慮到.

大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,然后用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）破裂細(xì)胞,SDS 具有的主要功能是：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；（2）解聚細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì),有助于消除染色體DNA上的蛋白質(zhì)；（3）SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R1—0—SO3R2—蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它除干凈.以免影響下一步RNase的作用.破細(xì)胞后RNA經(jīng)RNase消化除去,蛋白質(zhì)經(jīng)苯酚、氯仿:異戊醇抽提除去經(jīng)灑精沉淀回收DNA.枯草桿菌染色體制備與上類似,但略加修改的方法要適合教學(xué)要求.枯草桿菌是格蘭氏陽性菌,所以在SDS 處理前需要使用溶菌酶裂解細(xì)胞壁.溶菌酶是一種糖苷水解酶,它能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷鍵,有助于細(xì)胞壁破裂,破裂的細(xì)胞壁在SDS 的作用下溶菌,同時(shí)用蛋白酶K 消化蛋白質(zhì),能解離纏繞在染色體DNA上的蛋白質(zhì),然后加入一定量的醋酸鉀,使蛋白質(zhì)變性,通常離心除去,在這期間可加入核糖酸酶消化RNA,最后用乙醇回收DNA.

此二種方法抽提的細(xì)菌染色體DNA,無RNA和蛋白質(zhì)污染,可用于限制性內(nèi)切酶消化,分子再克隆等.但在下一步實(shí)驗(yàn)前,要測定其DNA的濃度,常用測定DNA 濃度的方法,是溴化乙錠電泳法；當(dāng)DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí),加入的EB 會(huì)增強(qiáng)發(fā)射的熒光.而熒光的強(qiáng)度正比于DNA 的含量,如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照,就可估計(jì)出待樣品的濃度。