一、動物免疫接種有哪些方法

1、皮下注射法

2、皮內(nèi)注射法

3、肌肉注射法

4、飲用水免疫法

5、刺種法

6、滴鼻、點眼法

7、氣霧免疫法

二、簡述人工制備單克隆抗體的方法？

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術(shù)是在細胞融合技術(shù)的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

制備過程:

1. 免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

2.細胞融合

采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。

3.選擇性培養(yǎng)

選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4.雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

5.單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。

(1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。

三、腦瘤細胞的培養(yǎng)步驟

瘤細胞的培養(yǎng)

雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實驗室采用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實驗室。

在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據(jù)檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節(jié)有關(guān)部分。

淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。

1、動物免疫

(1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

(2) 免疫動物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。

(3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞

融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。

表6-1 不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性 抗原量 接種次數(shù) 間隔時間 單抗的特性 抗體滴度 親和性

免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨后 2-3 每月 2-3月中等 強

B.10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月 每天 中等 中等

C.10-100ug 2 其后 4 其后“休息” 最后加強 每月 10天 1-2月

中等 中等或強

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結(jié)細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養(yǎng)上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。